Исследование биобезопасности, биосовместимости и остеокондуктивной активности стоматологических титановых штифтов Apolonia (Laser) и Apolonia (RBM).

Сабурина И.Н., Горкун А.А.

Лаборатория клеточной биологии и патологии развития

ГУ НИИ общей патологии и патофизиологии РАМН, г.Москва

Цель: исследовать штифты Apolonia (Laser) и Apolonia (RBM) на токсичность, сохранение стабильного фенотипа клеток in vitro, оценить жизнеспособность и пролиферативную активность клеток, их способность к остеогенной дифференцировке после заселения.

Для оценки цитотоксичности тестируемых штифтов и их влияния на эффективность прикрепления и пролиферации клеток были взяты культивированные постнатальные стромальные клетки подкожной жировой ткани (СКЖТ).

Этап 1. Исследование возможности прикрепления клеток к титановым штифтам.

В работе исследовали стоматологические штифты

Apolonia Implant (C3FW14 (Laser) 0900224, CSM) и

Apolonia Implant (C3FW14(RBM)070124, CSM).

Стоматологические титановые штифты в стерильных условиях переносили из упаковок фирм-производителей в четырехлуночные культуральные планшеты (НПП ПанЭко, Пн4). К штифтам добавляли суспензию клеток СКЖТ в количестве 60*10³ клеток на лунку. В отдельную лунку помещали контрольную суспензию клеток в том же количестве. Культивировали при 37°С в СО₂ инкубаторе (Jouan, США) в 0,5мл полной ростовой среды: ДМЕМ/F12 (1:1, С420:С600, НПП ПанЭко) с добавлением глютамина (2мМ L-глютамин, Ф031, НПП ПанЭко), гентамицина  (50мкг/мл, А012, НПП ПанЭко), ИТС (1:100) (инсулин, трансферин, селенит, Ф065, НПП ПанЭко), и 10% эмбриональной телячьей сыворотки (SH30109.03, HyClone). Замену среды производили каждые 2 дня. В среднюю часть культурального планшета для предотвращения испарения ростовой среды наливали 2мл раствора Хенкса (Р020, НПП ПанЭко).

Культуры ежедневно микроскопировали, оценивая степень конфлуэнтности и поведение клеток в присутствии штифтов, с помощью инвертированного светового микроскопа CKX41 (Olympus, Япония), фоторегистрацию осуществляли с помощью цифровой камеры DP300 (Olympus, Япония). При достижении клетками монослоя осуществляли пассирование культуры с использованием 0,25% раствора трипсина (П037, НПП ПанЭко), действие трипсина инактивировали добавлением полной ростовой среды. Избыток клеток переносили из культуральных планшетов на новые чашки Петри (Пк35, Пк60, Пк100, Corning, НПП ПанЭко), культивировали их в течение нескольких пассажей.

Этап 2. Оценка жизнеспособности и пролиферации клеток после культивирования со штифтами.

При каждом пассаже производили подсчет клеток в камере Горяева по схеме: считали клетки расположенные в центре квадрата, на его правой и нижней границах; обсчитывали 25 больших квадратов (Рис.1). Количество клеток в клеточной взвеси вычисляли по формуле:

N = N₂₅×2500×V_{кл.взвеси},

где N – количество клеток во всей взвеси;

N₂₅ – количество клеток в двадцати пяти больших квадратах,

V_{кл.взвеси} – общий объем клеточной взвеси.

Рис. 1. Камера Горяева, в которой производился подсчет клеток. Учитывали клетки, находящиеся в пределах четырех средних квадратов (один большой квадрат).

Для оценки жизнеспособности клеток отбирали 50мкл суспензии и окрашивали 0,4% раствором трипанового синего для определения погибших клеток (Рис.2).

Анализ ростовой кинетики клеточной популяции осуществляли с помощью двух параметров: коэффициента удвоения популяции (X) и времени удвоения популяции (TD). Данные параметры вычисляли с помощью формул:

X = [lgNh-lgNi]/lg2,

TD = t*lg2/[lgNh-lgNi],

где Nh – количество клеток пассажа №n,

Ni – количество клеток пассажа №(n-1),

t – время культивирования.

Рис. 2. Камера Горяева, в которой производили подсчет количества жизнеспособных и нежизнеспособных клеток. Нежизнеспособные клетки, окрашенные трипановым синим, указаны стрелками.

Этап 3. Исследование остеогенного потенциала клеток после сокультивирования со штифтами.

Для определения сохранения клетками способности дифференцироваться в остеогенном направлении после сокультивирования со штифтами клетки снимали со штифтов и преддифференцировали в индукционной среде по стандартной принятой методике в течении 2 недель, затем проводили молекулярное исследование СКЖТ на экспрессию специфических маркеров остеогенной дифференцировки: остеонектин, остеокальцин и коллаген по общепринятой методике.

Локус-специфическую ПЦР проводили с использованием пар праймеров для остеонектина (OSN F, OSN R), остеокальцина (OSC F, OSC R) и коллагена X (COL X F, COL X R)

Характеристики праймеров, использованных в работе.

Результаты

Для определения токсичности и биобезопасноти титановыхвых штифтов на клетки оценивали изменение морфологии клеток по мере культивирования, индекс пролиферации клеток после сокультивирования со штифтами и количество поврежденных клеток.

Значимых различий в морфологии клеток между экспериментальной и контрольной группами выявлено не было. В течение всего периода культивирования со штифтами клетки сохраняли характерный для них фибробластоподобный фенотип (Рис.3-6).

Рис.3. 2 день культивирования клеток со штифтом Apolonia (Laser) (А), со штифтом Apolonia (RBM) (Б) и контрольная группа клеток (В)

А

Рис.4. 5 день культивирования клеток со штифтом Apolonia (Laser) (А), со штифтом Apolonia (RBM) (Б) и контрольная группа клеток (В)

В

Рис.5. 7 день культивирования клеток со штифтом Apolonia (Laser) (А), со штифтом Apolonia (RBM) (Б) и контрольная группа клеток (В)

А

Рис.6. 12 день культивирования клеток со штифтом Apolonia (Laser) (А), со штифтом Apolonia (RBM) (Б) и контрольная группа клеток (В)

Клетки, исследуемые после сокультивирования со штифтами также не претерпели морфологических изменений (Рис.7,8).

А

Рис.7. Культура клеток СКЖТ на первом пассаже после сокультивирования со штифтом Apolonia (Laser) (А), со штифтом Apolonia (RBM) (Б) и контрольная группа клеток (В)

А

Рис.8. Культура клеток СКЖТ на третьем пассаже после сокультивирования со штифтом Apolonia (Laser) (А), со штифтом Apolonia (RBM) (Б) и контрольная группа клеток (В)

Анализ кинетики пролиферации клеток из подкожного жира после сокультивирования со штифтами показал отсутствие снижения пролиферации в сравнении с контрольной группой (Табл.1).

Таблица1. Значения параметров пролиферации для клеток, сокультивируемых со штифтами Apolonia (Laser) и Apolonia (RBM), и контрольной группы.

Исследуемая группа клеток	р1	р2	р3
	коэффициент удвоения
Apolonia (Laser)	1,63	2,43	1,17
Apolonia (RBM)	2,12	2,52	0,74
Контроль	2,67	1,75	0,92
	время удвоения
Apolonia (Laser)	29,45	19,83	47
Apolonia (RBM)	22,61	18,98	51
Контроль	17,96	27,5	50

Чтобы оценить жизнеспособность клеток после сокультивирования со штифтами, при каждом подсчете клеток отбирали 50мкл клеточной суспензии и окрашивали ее трипановым синим, способным проникать в поврежденные клетки. После сокультивирования со штифтами процент живых клеток составил 96-99% (Табл.2).

Таблица2. Данные по жизнеспособности для СКЖТ из подкожного жира после сокультивирования со штифтами Apolonia (Laser) и Apolonia (RBM) и контрольной группы.

Анализ гибели клеток после культивирования на образцах Apolonia (Laser) и Apolonia (RBM)

Прослежено три пассажа после культивирования на образцах

Попарные сравнения

А) Apolonia (Laser) и контроль

Б) Apolonia (RBM) и контроль

Клетки прикреплялись как к самим штифтам, обрастая их плотным слоем в течение всего периода культивирования так и к поверхности культуральных планшетов (Рис.9-10).

А

Рис.9. 4 день сокультивирования СКЖТ со штифтами Apolonia (Laser) (А) и Apolonia (RBM) (Б). Стрелками указаны прикрепившиеся клетки.

А

Рис.10. Плотная «шуба» из клеток по всей поверхности штифтов на 12 день сокультивирования СКЖТ со штифтами Apolonia (Laser) (А) и Apolonia (RBM) (Б). Стрелками указаны прикрепившиеся клетки.

На двенадцатый день эксперимента, штифты перенесли в новые культуральные планшеты в полную ростовую среду без суспензии клеток. Через несколько дней клетки мигрировали со штифтов на поверхность планшета, формируя клеточные скопления (Рис.11).

А

Рис.11. Миграция клеток с поверхности штифтов Apolonia (Laser) (A) и Apolonia (RBM) (Б) на 7 день после переноса штифтов на новые культуральные планшеты.

Результаты молекулярного исследования экспрессии генов остеогенеза в клетках СКЖТ после сокультивирования со штифтами

Рис.12. Очаги минерализации в культуре СКЖТ, сокультивированной со штифтами, после индукции остеогеной дифференцировки. Фазовый контраст.

Через 2 недели культивирования на индукционной среде клетки снимали с пластика и исследовали экспрессию генов, влияющих на остеогенез – остеонектина, остеокальцина и коллагена 10. Для этого проводили выделение тотальной РНК клеток и получали кДНК в результате реакции обратной транскрипции. Полученную кДНК использовали при постановке ПЦР со специфическими праймерами к интересующим генам. Контролем служила кДНК клеток, культивированных в интактной среде (без индукторов остеогенеза).

Была обнаружена экспрессия остеонектина, остеокальцина и коллагена 10 в исследуемых клетках (Рис. 13.). Этот факт свидетельствует о том, что клетки после сокультивирования с титановыми штифтами Apolonia (Laser) и Apolonia (RBM) не теряют способности становится коммитированными в остеогенном направлении.

а. б. в.

Рис. 13. Анализ экспрессии генов остеогенеза в клетках СКЖТ после сокультивирования со штифтами Apolonia (Laser) (1) и Apolonia (RBM) (2) и в контрольных клетках (К); а. экспрессия коллагена Х; б. экспрессия остеонектина; в. экспрессия остеокальцина

Вывод.

Титановые штифты Apolonia (Laser) и Apolonia (RBM) - биобезопасны, не обладают токсичностью по отношению к культивированным постнатальным стромальным клеткам подкожной жировой ткани (СКЖТ), которые на протяжении всего времени сокультивирования сохраняют высокую жизнеспособность и формируют плотный монослой как на поверхности самих штифтов, так и на прилежащем пластике;

- биосовместимы с культивированными на них клетками, не блокируя, не снижая, а поддерживая их высокий пролиферативный потенциал;

- сами штифты не блокируют и не изменяют потенции заселенных на них клеток под воздействием соответствующих индукторов дифференцироваться в остеогенном направлении, что подтверждается экспрессией специфических маркеров остеодифференцировки.